En 1900, Louis Massignon fait la rencontre de Joris-Karl Huysmans, qui influence grandement la suite de sa vie. L'année suivante, il visite l'Algérie. Il se spécialise sur le Maroc, et écrit un mémoire sur Léon l'Africain, explorateur musulman du XVe siècle, "Tableau géographique du Maroc dans les quinze premières années du XVIe siècle d'après Léon l'Africain". Ce "tableau" l'amène à un premier travail de terrain au Maroc, dans la région de Fès au printemps 1904 et une rencontre déterminante avec Charles de Foucauld. Il obtient son diplôme d'arabe classique et d'arabe dialectal à l'Ecole des langues orientales vivantes, et participe au XIVe Congrès des orientalistes d'Alger en 1905. Il s'installe au Caire où il est nommé membre temporaire de l'Institut d'archéologie orientale dirigé par le grand égyptologue Gaston Maspero, avec le fils duquel il est ami depuis le lycée. Il découvre le grand soufi Al-Hallaj, supplicia à Bagdad en 922, sur lequel il décide de faire sa thèse de doctorat ès lettres, qu'il soutient en 1922 devant la Sorbonne, "La passion d'Al-Hallâdj, martyre mystique de l'Islam".

En 1907, il est chargé d'une mission archéologique en Mésopotamie, et s'installe dans un quartier musulman de Bagdad, s'immergeant dans la culture arabe et musulmane. Il y fait également une expérience mystique déterminante, la rencontre avec la "présence divine" menant à sa conversion au "Dieu d'Abraham". Pendant la Première guerre mondiale, il est mobilisé comme officier dans l'Armée d'Orient, puis détaché à la mission diplomatique Georges-Picot en Orient, il est envoyé comme officier politique au sein de la première « Légion arabe » en formation en Égypte sous l'égide d'un projet franco-britannique. Il entre aux côtés de Lawrence d'Arabie dans Jérusalem envahie par les troupes occidentales. A la fin de la guerre, il est nommé professeur suppléant au Collège de France afin d'assurer des cours en sociologie et en sociographie musulmanes, puis en 1926, il y devient titulaire de la chaire de sociologie musulmane. il fonde la Revue des Etudes islamiques. En 1933-1934, il est à nouveau au Caire, où il est directeur d'études à l'École pratique des hautes études et fait partie des 5 Européens admis à l'Académie royale de Langue arabe. Il y fonde la Badaliya, tiers-ordre de prière pour le rapprochement islamo-chrétien. Dès la fin des années 1940, il s'engage en faveur des décolonisations en Palestine, au Maroc, en Algérie.

Islamologue, Louis Massignon a notamment réfléchi sur des archétypes communs entre islam et christianisme comme Abraham, Fâtima, la fille de Mahomet comme figure équivalent à la Vierge Marie, les Sept Dormants d'Ephèse, dont il cherchera à développer le pélerinage, Salmân al-Farîsi (ou Salmân Pâk), un chrétien converti et compagnon persan du prophète Mahomet. L'étude de ces expériences mystiques visant à la compréhension de l'Islam, fe l'intérieur. Homme de prière, il se fait ordonné prêtre dans le rite melkite au Caire en 1950. Il vécut des amitiés fortes avec Paul Claudel, François Mauriac, Jacques Maritain et Gabriel Marcel, et avec Taha Hussein et Alî Shariati, ses disciples et Iqbâl et Gandhi dont il fut le disciple.